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06.09.2021

La tecnologia del Dna ricombinante e il clonaggio

 

 

 

I microrganismi possiedono enzimi che permettono loro la difesa nei confronti dell’invasione da parte di DNA estraneo, come accade nella trasformazione (incorporazione di DNA libero nell’ambiente) o della trasduzione (attacco da parte di un virus). Protagonisti sono speciali nucleasi chiamate enzimi di restrizione, diventati in fretta protagonisti del mondo delle biotecnologie, in quanto essi sono speciali DNAsi che legano il DNA all’altezza di una particolare sequenza nucleotidica. Nello specifico, gli enzimi di restrizione di tipo II legano una sequenza di DNA palindroma e creano un taglio all’interno di essa. La specificità del legame è tale da permetterci, una volta sequenziato il DNA, di ricostruire con precisione quali enzimi di restrizione taglieranno e dove, ottenendo la cosiddetta mappa di restrizione. Ma l’applicazione più importante di tali proteine è il clonaggio, ovvero lo spostamento di un frammento di DNA all’interno di un altro (chiamato vettore o plasmide), in modo da ottenere una sequenza finale di interesse, mediante un vero e proprio taglia e cuci. Gli enzimi di restrizione tagliano, e le ligasi invece ricostituiscono i legami fosfodiesterici mancanti tra i nucleotidi. Alcuni enzimi di restrizione lasciano persino sequenze di DNA sporgenti, che possono incollarsi con estremità tagliate dallo stesso enzima, facilitando il clonaggio. La possibilità di unire insieme due frammenti di DNA tra loro slegati si trova alla base della tecnologia del DNA ricombinante, che ha aperto la strada allo sviluppo di una quantità pressoché infinita di combinazioni geniche.

Stanno tuttavia emergendo alternative all’uso degli enzimi di restrizioni, tali da funzionare a prescindere della sequenza protagonista (che magari non possiede siti di restrizione adeguati) e da incorporare più frammenti alla volta. È il caso dell’utilizzo della ricombinazione omologa naturalmente presente in alcuni organismi, come il lievito Saccharomyces cerevisiae, al quale possono essere forniti vari pezzi di DNA da unire. Questi hanno tra loro estremità complementari, ottenute via PCR o per costruzione di geni sintetici, e il lievito, potrà ricombinarli tra loro creando il plasmide desiderato, con i frammenti nell’ordine voluto, perché la complementarietà tra le estremità sarà specifica per le porzioni adiacenti. Poiché la probabilità che ciò accada è comunque bassa, selezioniamo i cloni vincenti mediante l’uso per esempio di antimicotici, il cui gene della resistenza è tra quelli da incorporare: solo le cellule che ce la faranno sopravvivranno. Poi potremo isolarli ed estrarre comodamente il plasmide finale senza dover usare enzimi di restrizione.

Con ambo le metodiche possiamo ottenere costrutti chimerici, ovvero sequenze che in natura non esistono, come per esempio combinazioni nuove di promotore – sequenza codificante – terminatore, ma anche proteine innovative, che presentano porzioni fluorescenti o che ne facilitino la purificazione.

 

Guarda il video:

  • L’uso del DNA ricombinante per la produzione di un farmaco

 

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